Extracto

Se presenta evidencia basada en el mecanismo para la eficacia contra el cáncer y la quimioprevención del [6] -gingerol, el principio activo principal de la planta medicinal, jengibre (
Zingiber officinale
), en células de cáncer de colon. El compuesto se evaluó en dos líneas celulares de cáncer de colon humano por su efecto citotóxico y la línea celular más sensible, SW-480, fue seleccionado para la evaluación mecánica de su eficacia contra el cáncer y la quimioprevención. La naturaleza no tóxica de [6] -gingerol se confirmó mediante ensayos de viabilidad en que se dividen rápidamente las células normales de colon de ratón. [6] -gingerol inhibe la proliferación celular y la apoptosis inducida como se evidencia por la externalización de la fosfatidilserina en SW-480, mientras que las células normales del colon no se vieron afectados. Sensibilidad a [6] -gingerol en células SW-480 estaba asociado con la activación de las caspasas 8, 9, 3 y amp; 7 y la escisión de PARP, que atestigua la inducción de la muerte celular apoptótica. Mecánicamente, [6] -gingerol fosforilación inducida por miristato acetato de forbol (PMA) regulada hacia abajo de ERK1 /2 y JNK MAP quinasas y la activación de AP-1 factor de transcripción, pero sólo tenía pequeños efectos sobre la fosforilación de p38 MAP quinasa y la activación de NF -kappa B. Además, se complementa con los inhibidores de cualquiera de ERK1 /2 o MAP quinasa JNK en la reducción de la proliferación celular inducida por PMA en células SW-480. Se presenta la inhibición de ERK1 /2 /JNK /AP-1 como un posible mecanismo detrás de la anticancerígeno, así como la eficacia de quimiopreventivo [6] -gingerol contra el cáncer de colon

Visto:. Radhakrishnan E, Bava SV , Narayanan SS, Nath LR, Thulasidasan AKT, Soniya EV, et al. (2014) [6] -gingerol Induce Apoptosis dependiente de caspasa y previene la proliferación inducida por PMA en células de cáncer de colon mediante la inhibición de la MAPK /AP-1 de señalización. PLoS ONE 9 (8): e104401. doi: 10.1371 /journal.pone.0104401

Editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, India

Recibido: 17 Marzo, 2014; Aceptado: July 13, 2014; Publicado: 26 Agosto 2014

Derechos de Autor © 2014 Radhakrishnan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel

Financiación:. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar

Conflicto de intereses:. Rubí Juan Anto es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.

Introducción

El cáncer de colon es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado y la tercera causa principal de mortalidad por cáncer en Estados Unidos. A nivel mundial, es la cuarta causa más común de mortalidad por cáncer. Las variaciones en el patrón de la dieta y el aumento de consumo de carne roja y procesada contribuyen a este aumento de la incidencia de cáncer de colon [1], [2] y procedimientos .Surgical la quimioterapia constituye los principales regímenes terapéuticos para el cáncer de colon [3]. El aumento de la resistencia a los medicamentos impide el tratamiento de cáncer de colon y los problemas asociados con la metástasis aumenta su gravedad. Se está buscando nuevos agentes terapéuticos que se dirige vías de señalización molecular en el cáncer de colon con el fin de detener su crecimiento y metástasis.

El jengibre (
Zingiber officinale
) ha sido durante mucho tiempo utilizado en la medicina tradicional y es denominado como "
Maha-aushadhi
" en Ayurveda, que significa "
la gran medicina
" [4]. El rizoma de jengibre contiene muchos compuestos fenólicos picante como [6] gingerol, [6] -shagol, [6] -paradol y zingerona [5] compuestos .Estas se han estudiado por sus propiedades anti-bacterianas, anti-oxidante, anti- inflamatorias y anti-tumorales [6], [7]. Muchos estudios han demostrado las propiedades anticancerígenas de estos compuestos fenólicos contra los cánceres de diversos orígenes. El rizoma de jengibre es un ingrediente de la dieta diaria en muchos países y es un ingrediente activo en muchos sistemas tradicionales de hierbas medicinales, como la medicina oriental y el Ayurveda, para la gestión de muchas enfermedades incluyendo la indigestión y otros trastornos gastrointestinales. Este conocimiento tradicional desencadena un interés particular en la caracterización de la naturaleza quimio-preventiva y anti-cancerosa de estos compuestos fenólicos contra los cánceres gástricos como el cáncer colorrectal o cáncer de páncreas.

Entre estos compuestos fenólicos, [6] -gingerol (1- [4 '-hidroxi-3'-metoxifenil] -5-hidroxi-3-decanona) ha sido estudiado por sus efectos citotóxicos en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal. [6] -gingerol fue mostrado para inducir la muerte celular en la línea celular de cáncer cervical, HeLa, por apoptosis dependiente de caspasa-3 y la autofagia [8]. Se podría inhibir la metástasis de MDA-MB-231 células de cáncer de mama e inducir la apoptosis en células de cáncer de próstata LNCaP [9], [10]. La administración de [6] -gingerol inhibió el crecimiento de varios tipos de tumores murinos tales como melanomas, carcinomas de células renales y carcinomas de colon mediante la mejora de las infiltraciones de linfocitos infiltrantes de tumor CD4 y las células T CD8 y B220
+ células B [11]. [6] -gingerol también ha demostrado inhibir la progresión de tumor de la piel inducido por éster de forbol en ratones ICR [12]. Sólo un número limitado de estudios han sido publicados sobre las propiedades anticancerígenas de [6] -gingerol y su mecanismo de acción contra el cáncer de colon [13], [14], [15].

En este estudio, la efectos citotóxicos de [6] -gingerol en SW-480 células de cáncer de colon se compararon con sus efectos sobre la que se dividen rápidamente las células epiteliales intestinales normales de ratón. El estudio también realiza un
in vitro
evaluación mecanicista sobre los efectos inhibidores de [6] -gingerol en forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) inducidos señales anti-apoptóticas en células SW-480.

Materiales y Métodos

2.1. Materiales

Se obtuvo un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) de Life Technologies (Grand Island, NY, EE.UU.); suero bovino fetal (FBS) a partir de PAN Biotech (GmbH, Aidenbach, Alemania); Solución salina equilibrada de Hank (HBSS), Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y la insulina, transferrina, selenio, solución de piruvato sódico (ITS-A) a partir de Invitrogen; Los anticuerpos contra fosfo-p38, fosfato ERK1 /2, fosfo-JNK, beta-actina y caspasas se adquirieron de Cell Signaling (Beverly, MA, EE.UU.) y anticuerpos contra poli ribosa ADP polimerasa (PARP) era de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). [6] -gingerol se adquirió de Biomol (Hamburg, Alemania). Los inhibidores de la MAP quinasa U0126, SP600125, SB203580 y NF-kappaB inhibidor SN50 se adquirieron de Calbiochem (San Diego, CA). Todos los demás productos químicos, incluyendo forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) fueron adquiridos de Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA).

2.2. Cultivo de células

líneas celulares de cáncer de colon humano, SW-480 y HCT116 se obtuvieron de Centro Nacional de Cell Sciences (NCCS), Pune, India. Las células fueron cultivadas en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), junto con 100 U /ml de penicilina, 50 microgramos /ml de estreptomicina y 1 microgramo /ml de anfotericina B. Se mantuvieron las líneas celulares en 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y se subcultivaron dos veces por semana.

células epiteliales intestinales normales (IECS) fueron aisladas de colon de ratón según el protocolo establecido [16], [17], con la adecuada modificaciones, tal como fue aprobado por el Comité ético de Animales institucional, Centro de Biotecnología Rajiv Gandhi según las reglas de la
Comité para los fines de control y supervisión de los experimentos con animales
, Ministerio de Medio Ambiente y Bosques, Gobierno de la India ( No sanción: AICE /151 /Ruby /2012). Brevemente, ratón (
Swiss albino
, 7 semanas de edad, AICE sancionar No: AICE /151 /Ruby /2012) de colon se diseccionó y se limpia de manera aséptica con 1 x solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para eliminar la materia fecal . El intestino se abrió longitudinalmente y se corta en trozos de 1 cm y se incubaron en presencia de tipo 1 de colagenasa (200 U /ml) durante 30 min con agitación vigorosa. Las células epiteliales desprendidas se aislaron por centrifugación el sobrenadante. Estas células se cultivaron en alta DMEM glucosa con 10% de FBS y 2 × antibióticos, que contienen 10 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico (EGF) y 5 mg /ml de insulina-transferrina-selenio-piruvato de sodio (ITS-A) (Invitrogen, EE.UU. ). Esta línea celular se mantuvo a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y fue sub-cultivadas vez en un mes.

2.3. El tratamiento con medicamentos

[6] -gingerol de stock (20 mg /ml) se preparó en etanol y las concentraciones de trabajo se prepararon por dilución de esta población en sufoxide de dimetilo (DMSO). Para el ensayo MTT, 5 × 10
3 células /pocillo de células de cáncer de colon humano y 10
4 células /pocillo de IEC de ratón Se sembraron en placas de 96 pocillos. Las células fueron tratadas con [6] -gingerol durante 48 h, 72 h o 96 h antes de realizar el ensayo de MTT y de 16 h antes de la tinción con anexina-V. PMA (5 mg /ml) se preparó en DMSO y se almacena a -20 ° C. En todos los tratamientos de combinación [6] -gingerol se añadió 2 h antes del tratamiento con PMA. En ensayo de viabilidad celular /transferencia de Western para los tratamientos de combinación con inhibidores de la MAP quinasa (2,5 micromolar U0126, 5 micromolar SP600125, SB203580 1'micromolar) o un inhibidor de NF-kappaB (18 micromolar SN50), las células se trataron primero con el inhibidor durante 1 h y posteriormente pre-tratado con [6] -gingerol de 2 h, seguido de exposición a PMA durante 48 h antes de realizar el ensayo de MTT. Por movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA), 10
6 células de SW-480 se sembraron en placas de 60 mm y las células fueron pretratadas con [6] -gingerol durante 2 h y luego con PMA durante 30 min.

2.4. La viabilidad celular de ensayo

efectos citotóxicos de [6] -gingerol se determinó mediante el ensayo de MTT como se describió anteriormente [18] y el porcentaje de viabilidad celular relativa se expresa como [A
570 de los pocillos tratados /A
570 de pocillos no tratados × 100].

2,5. Anexina V-yoduro de propidio tinción

La membrana flip-flop inducida por 16 h de tratamiento con [6] -gingerol fue analizado por tinción de las células con isotiocianato de fluoresceína conjugado de Anexina V /PI (Santa Cruz Biotechnology) según las instrucciones del fabricante y las células apoptóticas se fotografiaron bajo el microscopio fluorescente [19]. El número total de células en el campo microscópico se contó bajo un microscopio de contraste de fase y el número de células fluorescentes en el mismo campo se contó bajo un microscopio de fluorescencia. La fracción de células fluorescentes a número total de células se representa como porcentaje de células apoptóticas. Esto se repitió en varios campos del mismo bien y el promedio fue tomada para el trazado.

2.6. Inmunotransferencia

La proteína total aislado de las células después de los tratamientos, con o sin PMA [6] -gingerol /, se sometieron a transferencia de Western como se describe anteriormente [20]. En resumen, 60 microgramos de lisado de células enteras se separó en un gel de poliacrilamida al 10-15%, se transfirieron a una membrana de PVDF, se sondaron con anticuerpo correspondiente y se detectó utilizando ECL (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.).

2,7. Cambio de movilidad electroforética de ensayo (EMSA)

EMSA se realizó para evaluar la actividad de unión al ADN de NF-kappa B o AP-1 factores de transcripción en las células tratadas con PMA y /o [6] -gingerol, como se ha descrito anteriormente [21]. En resumen, 10 microgramos de proteínas nucleares, aislado de las células después de los tratamientos con fármacos, se incubaron durante 30 minutos con
32P-final-etiquetados oligonucleótido bicatenario de 45 mer para NF kappa B (5'TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3 '; a 37 ° C) o un oligonucleótido 21-mer de AP-1 (5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3 '; a 30 ° C) y se resolvió el complejo de proteínas de ADN en gel de 6,6% no desnaturalizante de poliacrilamida, que se secó y se visualizó en Fósforo Imager (Molecular Imager FX personal; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).

2.8. Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado (n = 3). Las barras de error representan ± desviación estándar (S.D.) de los experimentos. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student y los símbolos *, ** y *** representa los valores de p, p = 0.05, p≤0.005 y p≤0.001 respectivamente.

Resultados

3.1. [6] -gingerol induce citotoxicidad dependiente de la dosis en células de cáncer de colon mientras que las células epiteliales intestinales normales no se ven afectadas

[6] -gingerol se proyectó por sus efectos citotóxicos sobre SW-480 y las células HCT116 a diversas concentraciones que van desde 5 micromolar a 300 micromolar, durante 72 h, usando un ensayo de MTT. cambios dependientes de la dosis en la morfología celular eran claramente evidentes bajo el microscopio de contraste de fase (Fig. 1A). Los resultados muestran [6] -gingerol para ser citotóxico hacia ambas células SW-480 y HCT116 de una manera dependiente de la dosis, con la citotoxicidad prominente en concentraciones más altas que producen un IC
50 valor de 205 ± 5 micromolar y 283 ± 7 micromolar , respectivamente (Fig. 1B y Fig. 1C) .El efecto fue más prominente en el caso de SW-480 de HCT116 y por lo tanto el anterior se utilizó en todos los estudios adicionales. Por el contrario, los resultados de ensayo de MTT con el ratón IEC normales revelaron sólo el 10-15% de citotoxicidad incluso al doble de la IC
50 concentración de [6] -gingerol contra el número y la morfología celular celular SW-480.The fue visto en gran parte no afectado incluso a 500 micromolar de [6] -gingerol (Fig. 2A). Estudiar el efecto dependiente del tiempo de [6] -gingerol a las concentraciones eficaces reveló un aumento de la citotoxicidad de las células SW-480 en el tiempo de 48 h a 96 h, aunque la viabilidad de las células de IEC normales de ratón se mantuvo sin cambios (Fig. 2B) resultados .Estas sugieren la especificidad de [6] -gingerol en la inducción de la citotoxicidad en células cancerosas sin ser tóxico para las células normales, incluso a concentraciones más altas.

imágenes de contraste de fase de microscopía de cambios morfológicos en las células SW-480 (a) cuando se tratan con concentraciones indicadas de [6] -gingerol para 72 h. (B) la viabilidad celular relativa de las células SW-480 a partir de [6] tratamiento -gingerol, determinados mediante el ensayo de MTT y se expresaron como porcentaje del control sin tratar. 5000 células /pocillo de células SW-480 se trataron con la concentración indicada de [6] -gingerol por 72 h antes de MTT ensayo. (C) la viabilidad celular relativa de las células HCT-116 a partir de [6] -gingerol tratamiento. Los resultados se representan como la media de tres experimentos ± desviación estándar (SD).

(a) Fase de imágenes de microscopía de contraste de IEC tratados con las concentraciones indicadas de [6] -gingerol durante 72 h. (B) depende del tiempo efectos citotóxicos de [6] -gingerol en SW-480 y IEC en 48, 72 y 96 h. 5000 células /pocillo de SW-480 y 10.000 células /pocillo de IEC se trataron durante 48 a 96 h con dosis indicadas de [6] -gingerol antes de MTT ensayo. Los resultados se representan como media ± SD de tres experimentos.

3.2. [6] -gingerol induce la apoptosis en células de cáncer de colon, pero no en células epiteliales intestinales normales

Con el fin de evaluar si la inducción de citotoxicidad por [6] -gingerol está mediada por apoptosis, la membrana flip-flop y la externalización de phosphotedylserine fueron controlados en las células SW-480 [6] -gingerol tratados mediante la realización de Anexina-V /PI tinción. Los resultados de la tinción con anexina-V /PI confirmaron los primeros eventos de apoptotis en células SW-480 [6] -gingerol tratados, como es evidente por el aumento dependiente de la dosis en las células fluorescentes (Fig. 3A) .Los resultados de estudio similar realizado en IEC ratón mostró sólo número insignificante de células fluorescentes, incluso a 500 micromolar de [6] -gingerol treatment.100 micromolar 5-Fluro uracilo (5-FU) sirvió como control positivo para anexina V tinción en IEC normales (Fig. 3B ).

(a, panel superior) SW-480 células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de [6] -gingerol durante 16 horas y se tiñeron para anexina V /yoduro de propidio positividad (PI). Green-fluorescencia indica Anexina de unión a la membrana celular dañada V durante la apoptosis temprana y la fluorescencia roja indica la unión al ADN expuesto PI durante finales de la apoptosis. (A, panel inferior) Representación gráfica del porcentaje de células con anexina V /PI positivas SW-480 en relación con [6] la concentración de gingerol. (B, panel superior) IEC se trataron con hasta 500 M de [6] -gingerol durante 16 h antes de realizar Anexina V-PI tinción. El tratamiento con 100 M 5-FU se utilizó como control positivo para la inducción de apoptosis. (B, panel inferior) histograma Representante del porcentaje de positivos IEC anexina /PI después del tratamiento [6] -gingerol /5-FU. Los resultados se representan como la media de tres experimentos ± SD.

También analizaron los extractos celulares a partir de células SW-480 tratadas con [6] -gingerol para la activación de las caspasas-8, 9, 3 , 7 y la escisión de PARP mediante experimentos de inmunotransferencia. Las caspasas son una familia de cisteína proteasas que se activan durante el programa de apoptosis. Se ha observado una escisión significativa de procaspasa 8 a sus fragmentos activos (P43 /41) y la procaspasa 9 de sus fragmentos activos (p35 /37) (Fig. 4A y 4B). La activación de las caspasas efectoras 3 y 7 también fueron inducidos por [6] -gingerol de una manera dependiente de la dosis, la escisión de la procaspasa-3 a sus fragmentos activos (p17 /19) y la mejora de la escisión de la procaspasa-7 a su fragmento activo (p20) (Fig. 4C y 4D). Por último, se examinó la escisión del DNA de reparación de proteínas, PARP, que es un sustrato de la caspasa-3.Upon el tratamiento de las células con 200 y 300 micromolar de [6] -gingerol, la forma 116-kDa de la PARP se escindió a la 89 fragmento kDa (Fig. 4E), lo que confirma una apoptosis mediada por caspasa. Desde 200 micromolar de [6] -gingerol fue la activación de caspasas de manera eficiente que conducen a la escisión de PARP y la apoptosis, esta concentración se utilizó en estudios adicionales de señalización.

SW-480 células (10
6 células /pocillo) se tratados con las concentraciones indicadas de [6] -gingerol durante 48 h y el conjunto de extractos celulares se sometieron a transferencia Western a membrana de PVDF. La activación de las caspasas y la escisión de PARP se detectaron mediante el sondeo de la membrana sometida a transferencia con anticuerpos contra la caspasa-3, 7, 8, 9 y en contra de PARP. Las transferencias fueron desarrolladas utilizando quimioluminiscencia (ECL). Las veces las diferencias relativas de las bandas con tratamientos de control se cuantificaron a partir del análisis del volumen de las bandas utilizando un software Cantidad Biorad-. ß-actina sirvió como control de carga en cada caso.

3.3. [6] -gingerol inhibe la activación de las MAP quinasas PMA-inducida en células SW-480

PMA es un promotor de tumores bien conocida que activa isoenzimas casi toda la proteína quinasa C (PKC), que son importantes reguladores de aguas arriba de (MAP) quinasa activada por mitógenos proteína [22], [23] .Los cinética de la fosforilación de Ras /Raf /quinasa regulada por señales extracelulares (ERK1 /2), c-Jun NH2-terminal quinasa (JNK) y se estudió p38 MAP quinasa en las células SW-480 en respuesta al tratamiento con 50 ng /ml (80 nM) PMA para diferentes intervalos de tiempo. El análisis de transferencia Western reveló una fosforilación dependiente del tiempo de ERK1 /2, JNK y p38.In los tres casos, la fosforilación fue evidente a 5 min de tratamiento con PMA y alcanzó un máximo de 30 min y luego retrocedió de 120 min (Fig. 5A). El efecto de [6] gingerol sobre la fosforilación transitoria inducida por PMA de MAP quinasas se estudió en células SW-480 PMA tratados 30 min, pretratado con 200 micromolar [6] -gingerol durante 2 h. Curiosamente, [6] - gingerol pretratamiento abolió la fosforilación transitoria inducida por PMA de ERK1 /2 y JNK casi por completo, pero sólo abolió parcialmente la fosforilación de p38 MAP quinasa en las células SW-480 (Fig 5B).

(A) una noche cultivados SW-480 células fueron tratadas con 50 ng /ml de PMA para diferentes intervalos de tiempo (0-120 min) y todo el lisado celular se inmunotransfirieron sobre una membrana de PVDF, probaron utilizando anticuerpos contra fosfo-ERK1 /2, fosfato JNK y fosfato p38, desarrollada por ECL. La cinética de la fosforilación inducida por PMA de estas MAP quinasas fueron seguidos de esta blot (B) células SW-480 se pre-trataron con 200 M [6] -gingerol antes del tratamiento con 50 ng /ml de PMA durante 30 min y el conjunto lisados ​​celulares se inmunotransfirieron, probaron y se detectaron como anteriormente. La diferencia relativa de pliegue bandas con tratamientos de control se indican a continuación cada carril. β-actina sirvió como control de carga en cada caso. (C) SW-480 células, pre-tratados con las concentraciones indicadas de [6] -gingerol de 2 h, se trataron con PMA (50 ng /ml) durante 30 min. Los extractos nucleares de cada tratamiento se analizaron para la activación de AP-1 o (D) NF-kappaB, por la realización del ensayo en isótopo sonda marcada de unión a ADN específica AP-1 /NF-kappaB de unión de la transcripción y analizarla en cambio de movilidad electroforética ensayo (EMSA). La punta de flecha en cada caso indica complejos entre el AP-1 /NF-kappaB y la sonda de ADN.

3.4. [6] -gingerol inhibe la actividad de unión de la transcripción de PMA inducida por AP-1, pero no NF-kappaB, en SW-480

PMA es un activador bien conocido de los factores de transcripción AP-1 y NF kappaB en diferentes células del cáncer [24], [25], [26], [27]. Para determinar la actividad de unión transcripcional de AP-1 en SW-480, inducida en respuesta a PMA, extracto nuclear de las células tratadas con 50 ng /microlitro PMA para se utilizó 1 h para EMSA. Se observó una activación dependiente de la dosis clara de AP-1 en células SW-480 al tratamiento con PMA (figura 5C;. El carril 5) .A dependiente de la dosis baja regulación de esta inducida por PMA se observó unión de AP-1 a 2 horas antes -Tratamiento con [6] -gingerol (figura 5C;. carril 6-8). [6] pretratamiento -gingerol no mostró un efecto drástico en la propiedad de unión transcripcional de NF-kappaB, a pesar de que hubo una inhibición significativa de la unión del ADN a 300 micromolar [6] -gingerol (Figura 5D;. Carril 6-8 ).

3.5. [6] -gingerol inhibe la proliferación celular inducida por PMA en SW-480 a través de la inhibición de la quinasa vías ERK1 /2 y JNK MAP

Con el fin de entender mejor los detalles de la mecánica detrás de los efectos inhibitorios de [6] - gingerol sobre las vías de señal activadas por PMA en SW-480, la viabilidad y proliferación de células SW-480 fueron monitorizados mediante el ensayo MTT después de tratarlos con varias combinaciones de PMA, [6] -gingerol e inhibidores de MAP quinasas o NF-kappaB. Principalmente, el tratamiento PMA aumentó la proliferación de las células SW-480 de manera significativa. Pero, [6] -gingerol pre-tratamiento de las células provocó la caída del PMA-inducir la proliferación drásticamente. Sin embargo, la viabilidad de las células SW-480 a partir de [6] -gingerol tratamiento fueron comparativamente mayor en presencia de PMA (Fig. 6A).

(A) una noche cultivados células SW-480 fueron tratadas previamente con inhibidores ( U0126, SP600125, SB203580 para /2, JNK y p38 MAP quinasas ERK1, respectivamente o SN50 para NF-kappaB) durante 1 h y después se trató con [6] -gingerol de 2 h, seguido de exposición a PMA durante 48 h, antes de la realización de ensayo de viabilidad celular usando MTT. La viabilidad relativa de células SW-480 en cada tratamiento representado como porcentaje de control no tratado. Los valores presentados son la media de tres experimentos ± SD. Total de lisados ​​de células tratadas con la combinación de [6] -gingerol con inhibidores de (B) U0126 y SP600125 (C) y de los tratamientos de control apropiadas fueron borrados Western y se sondaron con anticuerpo anti-caspasa-3 y las transferencias se desarrollaron usando ECL. Beta-actina sirvió como control de carga.

A continuación, se lleva a cabo los mismos experimentos sobre células SW-480 pre-tratados con inhibidores de miembros de la familia MAP quinasa y NF-kappaB. U0126 fue utilizado como un inhibidor específico de ERK1 /2 vía, SP600125 como un inhibidor de la activación de JNK y SB203580 como el inhibidor de p38 MAP quinasa pathway.SN50 fue utilizado como un inhibidor del factor de transcripción NF-kappaB. Ninguno de los inhibidores anteriores tuvo ningún efecto citotóxico sobre las células SW-480 a la concentración (Fig. 6A) probado. Pero, pre-tratamiento con U0126 y SP600125 redujo significativamente la proliferación inducida por PMA de las células SW-480 a la misma extender, aunque en menor medida en comparación con [6] -gingerol pre-tratamiento (Fig. 6A). Estos resultados demuestran el papel esencial de las quinasas ERK1 /2 y JNK MAP vías en la inducción de la proliferación de células SW-480 en presencia de PMA. El pretratamiento con SB203580 y SN50 tuvo poco efecto sobre la proliferación inducida por PMA de las células SW-480 (Fig. 6A), lo que demuestra la falta de implicación de la vía de p38 MAP quinasa y el factor de transcripción NF-kappaB en este proceso.

Finalmente, [6] -gingerol tratamiento se realizó en células SW-480 pre-tratados con cada uno de los inhibidores anteriores antes de la inducción con PMA. Sorprendentemente, en cada caso, la viabilidad celular se reduce a un nivel similar a la de pre-tratamiento con solamente [6] -gingerol tratamiento antes de PMA. Este resultado sugiere que, en presencia de U0126, [6] -gingerol complementa esta ERK1 inhibidor /2, mediante la anulación de la activación de JNK MAP quinasa y, en presencia de SP600125 inhibe la activación de ERK1 /2, lo que reduce la viabilidad celular a la misma nivel en ambos casos. En presencia de inhibidores de SB203580 y SN50 [6] -gingerol ejerce sus efectos inhibidores sobre las dos vías ERK1 /2 y JNK MAP quinasa, por lo tanto hace bajar la viabilidad de las células al mismo nivel que el anterior. Estos resultados atestiguan el igual contribución de ambas vías de MAP quinasa ERK1 /2 y JNK en [6] -gingerol mediada por la inhibición de la proliferación celular inducida por PMA de SW-480. Puesto que no hay efectos aditivos o inhibitorios sinérgicos sobre la proliferación de las células tratadas con PMA SW-480 resultantes de pre-tratamiento con la combinación de [6] -gingerol con U0126 o SP600125, en comparación con el tratamiento previo con [6] -gingerol solo , ERK1 /2 y JNK MAP quinasa parece ser las vías de señalización claves afectados por [6] -gingerol durante la inhibición de la proliferación celular inducida por PMA en SW-480.

con el fin de probar si los efectos inhibitorios en la proliferación celular inducida por PMA de SW-480 células por [6] -gingerol, con la mediación de la apoptosis o U0126 SP600125, que supervisó la activación de la caspasa 3 de cada uno de estos tratamientos por Western Blot. Se observó la escisión de la procaspasa 3 en todos los tratamientos que implican [6] -gingerol, U0126 o SP600125 y en combinación de [6] -gingerol y estos inhibidores (Fig. 6B y 6C). También es interesante observar que sin degradación adicional de la banda madre caspasa 3 se produjo cuando se utilizaron los inhibidores y el gingerol juntos. Esto demuestra que la baja regulación de ERK1 /2 /JNK /AP-1 inducida por PMA, es responsable de los efectos inhibitorios de [6] -gingerol sobre la proliferación celular inducida por PMA en SW-480.

discusión

anti-cáncer y propiedades anti-inflamatorias de [6] -gingerol ha sido reconocida desde hace mucho tiempo y muchos estudios han informado de diferentes mecanismos moleculares detrás de estas propiedades. Los efectos inhibidores de [6] -gingerol contra cánceres de diversos orígenes se informó anteriormente. [6] -gingerol ha demostrado ser particularmente eficaz contra el carcinoma de piel y en la inhibición de la angiogénesis en las células endoteliales [28], [29]. El jengibre es un suplemento dietético y un ingrediente importante en muchos medicamentos tradicionales, es lógico para estudiar los efectos de [6] -gingerol sobre el cáncer del tracto gastrointestinal, tales como el cáncer de colon. Por otra parte, los estudios farmacocinéticos en los componentes activos de jengibre a partir de extractos de jengibre administrados por vía oral en los seres humanos detectan un importante los niveles de [6] -gingerol, ya sea en forma libre o conjugado, en el plasma y de colon tejidos [30], [31]. Otro estudio sobre la biodisponibilidad de [6] -gingerol en ratas sugiere que cuando se administra por vía oral se detecta en concentraciones de 4.3 mg /ml en plasma a los diez minutos después de la administración. El mismo estudio también determinó su alta distribución en los tejidos con mayor concentración en los tejidos del tracto gastrointestinal. El tejido a la proporción de plasma de [6] -gingerol se informó a ser & gt; 1 y se atribuyó a su lipofilia [32]. Todos estos hechos apoyan un estudio sobre los efectos anticancerígenos de [6] -gingerol sobre el cáncer de colon.

La primera década del siglo 21
st tenían un mayor número de estudios sobre la caracterización de los mecanismos detrás de la lucha contra efectos: cáncer de fitoquímicos. Los estudios sobre la evaluación mecánica de las propiedades anticancerígenas de [6] -gingerol contra diferentes tipos de cáncer proporcionado información valiosa sobre sus múltiples mecanismos de acción en el logro de citotóxicos o pro-apoptóticos efectos en las células cancerosas. Algunos informes recientes sobre las actividades contra el cáncer de [6] -gingerol contra el cáncer de colon presentan diferentes mecanismos para su acción en diferentes líneas celulares de cáncer de colon [13], [14], [15], [33]. El presente estudio sobre la línea celular SW-480 demuestra la
in vitro
citotoxicidad de [6] -gingerol con una CI
50 valor de 205 micromolar. El estudio anterior en
in vitro
efectos citotóxicos de [6] gingerol sobre la línea celular SW-480 comunica solamente la muerte celular 17% a esta concentración [13] diferencias .Estas en la magnitud de los efectos podría ser debido a las variaciones en el método utilizado en el estudio de la citotoxicidad. También es de destacar que el mismo estudio informó sólo el 13% de citotoxicidad en células LoVo cuando se tratan con 200 micromoles de [6] -gingerol durante 72 h, que se informó más tarde en un estudio diferente en un 75% a 50 micromolar en la misma línea celular después de 48 h de tratamiento [15]. El aumento dependiente de la dosis en las células apoptóticas (células positivas Anexina-V /PI) en las células SW-480 tras el tratamiento con [6] -gingerol, hasta 25 pliegues en 300 concentración mu M, demostró que la citotoxicidad fue inducida principalmente por apoptosis. Anteriores estudios informaron tanto la detención del ciclo celular y la apoptosis como el mecanismo de acción de [6] -gingerol [13], [34]. aumento de dos veces en la apoptosis se informó en condiciones similares en SW-480 [13], sino que también demostró G2 significativa /M detención del ciclo celular en respuesta a [6] -gingerol tratamiento. Muchos informes anteriores sugirieron que [6] -gingerol induce apoptosis solamente en o cerca de 300 micromolar en células de cáncer [13], [34], [35], [36] y por debajo de esta concentración que induce citotoxicidad principalmente por otros mecanismos. Sin embargo, observamos células fluorescentes en SW-480 tratado con incluso 100 micromolar [6] -gingerol, lo que sugiere claramente eventos apoptosis temprana incluso a concentraciones más bajas. Además, la activación dependiente de la dosis de las caspasas-8,9, 3 y 7 en nuestro estudio confirmó además apoptosis como el principal mecanismo de la muerte celular en las células SW-480 tratadas con [6] -gingerol. La activación de la caspasa-9 por [6] -gingerol confirma la participación de la ruta mitocondrial en [6] apoptotis -gingerol mediada. Sin embargo, la escisión de la caspasa-8 inducida por [6] -gingerol no puede sugerir esencialmente la implicación de la vía mediada por el receptor, como vía mitocondrial también podría dar lugar a la escisión de la caspasa-8 a través de la escisión de BH3 agonista muerte interactuar-dominio (BID ) [37]. La inducción de la apoptosis en SW-480, una línea celular de cáncer de colon de p53 mutante, por [6] -gingerol es particularmente interesante ya que se consideran células p53 mutante a ser más resistentes a agentes quimioterapéuticos y la radiación [13] estándar, [36]. la inducción de p53-independiente de la apoptosis por [6] -gingerol se informó anteriormente en líneas celulares de cáncer de páncreas, donde la expresión del inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, p21
CIP1, se aumentó independiente de la expresión de p53 conduce a la disminución de ciclina A y